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短波紫外線照射血手印對其后PCR-STR DNA檢驗的影響研究

作者:畢思特科技 來源:畢思特科技 瀏覽數:2880 發布時間:2018/11/12 10:34:51

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短波紫外線照射血手印對其后PCR-STR DNA檢驗的影響研究

摘要:目的 探討短波紫外線照射血手印對其后熒光PCR—STR DNA檢驗的影響。方法 用短波紫外線(254nm)垂直照射載玻片上的血涂層,分不同血樣量照射不同時間。提取血涂層用熒光PCR—STR復合擴增方法檢測16個位點基因型。結果 隨著照射時間的延長,各樣品檢出STR位點的個數呈下降趨勢,且各位點等位基因的平均峰面積也呈下降趨勢。其中,2μL血涂薄層單次照射后的檢測結果:15s,30s,120s無影響;300s,1hour有不同程度影響;重復照射的檢測結果:15s+15s,30s+30s無影響;120s+120s,300s+300s有不同程度影響。5μL血涂薄層與2μL血涂薄層相比,單次照射結果無明顯差異,重復照射結果有明顯差異。結論 在用短波紫外線照射處理血手印時,單次照射時間不超過120s,總照射時間不超過240s,以保證隨后的PCR-STR DNA檢驗能達到所需位點數的最低要求。

關鍵詞:短波紫外線;  血手??;  PCR-STR; DNA

目前,對于有些現場血手印多采用紫外反射照相顯現技術提取指紋,由于紫外線的照射,尤其是短波紫外線的近距離照射往往對隨后血手印的DNA檢測結果有不同程度的影響[1],有些甚至因照射無法檢出正確的基因型,影響證據的獲取。

本文報道經短波紫外線垂直照射血涂薄層不同時間后,用ABI公司熒光PCR—STR試劑盒檢測16個位點的基因分型結果,對不同照射時間、不同量血樣的STR位點檢出情況進行了試驗性探討研究。

1  材料

   新鮮抗凝人血5mL由中山市博愛醫院血站提供。

2  方法

2、1 血手印的制備

現場血手印多為薄層血跡,本文采用新鮮抗凝血均勻涂于純酒精清洗過的載玻片表面形成血薄層作血手印試驗樣本。取2μL和5μL混勻的新鮮抗凝血均勻涂布于載玻片表面形成20mm╳40mm血涂薄層,制備時,用另一載玻片邊緣拖住血滴輕輕移動。血涂薄層紫外線照射處理前室溫條件下保存于黑暗環境中48h。

2、2  短波紫外線照射

 用254nmAr+激光光源(SIRCHIE Krimesite SCOPE紫外勘查照相系統)垂直照射載玻片表面的血涂薄層,參數見表1。本文采用了不同量血樣與不同照射時間兩種條件。照射完畢后樣品保存于黑暗通風環境下2-24h后進行下一步驟。每組均取一無照射樣本作對照。

2、3  DNA提取

 用浸濕純凈水的干凈單根棉線(5-8cm長)2-3根輕輕擦拭血薄層,直至將血跡提取完為止,所提血跡按Walsh 等[2]Chelex-100方法提取。其中2μL血薄層用100μL體系,5μL血薄層用200μL體系。

2、4  PCR反應

采用ABI 公司 AmpFLSTR®  IdentifilerTM PCR 擴增試劑盒分別擴增各樣本,

10μL反應體系中含反應緩沖液4μL,引物混合物2μL,AmpTaq DNA聚合酶1U,ddH2O2.8μL, Chelex-100提取上清1μL。

PCR熱循環參數:95°C11min熱變性后,進入28個循環:94°C 1min,59°C 1min,72°C  1min,最后60°C保溫60 min。

2、5  PCR產物檢測

 PCR擴增產物在ABI公司310毛細管凝膠電泳遺傳分析儀上檢測,取1μL  PCR擴增產物與10μL上樣混合液(甲酰胺:Liz500=10.5:0.5), 95°C變性3min后電泳。

2、6  基因分型與數據分析

 用ABI公司Genescan和 Genotyper 分析軟件對各樣本電泳結果進行分析,并將各等位基因片段的平均峰面積進行比較,制成柱形圖。

3 結果與討論

 2μL血涂薄層,單次照射15s,30s,120s后,15個STR位點和1個Amelogenin

位點均檢出基因型;300s后,除D18S51、FGA兩個位點未檢出外,其余14個位點均檢出;1hour后,僅有D18S51、D21S11、CSF1PO、D5S818、Amelogenin 5個位點檢出基因型,其余11個位點未檢出。與對照組相比,從15s到300s,隨著照射時間延長,各位點等位基因平均峰面積呈下降趨勢(另文發表)。1hour照射后,11個位點擴增失敗。

2μL血涂薄層,重復照射15s+15s,30s+30s后,15個STR位點和1個

Amelogenin位點均檢出基因型;120s+120s后,檢出11個位點,其余D7S820、D2S1338、D18S51、D5S818、FGA、Amelogenin共 5個位點未檢出;300s+300s后,僅有D2S11、D3S1358、D16S539、D19S433 共4個位點檢出,其余12個位點均未檢出,見表2。隨著照射時間延長,各位點等位基因平均峰面積呈明顯下降趨勢(另文發表)。

5μL血涂薄層與2μL血涂薄層相比,單次照射15s,30s,120s,300s,1hour后,檢出結果無明顯差異。重復照射15s+15s,30s+30s后,檢出結果無明顯差異;120s+120s后,2μL血涂薄層檢出10個位點,5μL血涂薄層檢出15個位點;300s+300s后,2μL血涂薄層僅檢出4個位點,5μL血涂薄層檢出15個位點,見表2。隨著照射時間延長,單次和重復照射后各位點等位基因片段平均峰面積也呈明顯下降趨勢(另文發表)。

利用紫外反射照相顯現指印是目前痕跡檢驗中一種較常見且有效的無損檢驗方法,但由于在照射血手印的過程中,短波紫外線會對血跡中的DNA成分產生破壞,Julia Andersen [1]曾用Ar+激光、多波段綠光、Superlite和短波紫外線等五種不同光源照射血涂薄層后的DNA含量進行點雜交定量分析,發現短波紫外線(255nm)照射30s后血指印DNA大片段明顯減少,甚至無法檢測到DNA片段,而其它四種光源均無影響。其隨后用vWA、TH01、F13A01、FES/FPS四個位點的復合擴增熒光檢測,發現短波紫外照射30s內對擴增效果無影響,但超過30s則無法檢出四個位點的基因型。

本研究采用ABI公司Identifiler 熒光標記引物試劑盒擴增各樣本,并結合310毛細管凝膠電泳遺傳分析儀進行電泳檢測分析,同樣是2μL血涂薄層,當照射時間為120s時,可完全檢出16個位點;當照射時間為120s+120s時,仍可檢出10個位點。另外,血量為5μL的血涂薄層,照射時間為300s時,可檢出15個位點;照射時間為1hour時,仍可檢出5個位點。這與ABI公司Identifiler 熒光標記引物試劑盒的檢測靈敏度和310毛細管凝膠電泳遺傳分析儀的檢測靈敏度有很大提高有關。另外,本研究所制作的2μL血涂薄層面積為20mm╳40mm,而Julia Andersen報道用的血涂層是51mm╳76mm,這與血涂薄層的厚薄也可能有一定關系,但本研究所用血涂層厚度比較接近實際案件中遇到的真正血手印厚度。

本研究所用血手印是用新鮮血液在干凈載玻片上形成血涂薄層代替,在實際案件中,因血手印可能比較陳舊,且有時會有各種環境污染,因而,所獲得的結果可能會有一定的差異。提示在實際檢案中,如需對血手印進行DNA檢測時,應考慮血手印的厚薄以及新鮮程度,照射時間應控制在120s以內,盡量避免長時間照射,以保證后續PCR—STR 的DNA檢驗。

另外,要弄清短波紫外線照射血手印對其后PCR—STR檢驗影響的原因,下一步將對照射后的血手印提取的DNA進行含量以及片段損傷程度作進一步的定量及電泳分析,并同時針對案件中短波紫外線照射后的血手印進行分析,以評價其真正的影響程度。

 

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